Hver er munurinn á hefðbundnu PCR kerfi og rauntíma PCR kerfi?


svara 1:

Í stuttu máli, meginreglan er sú sama: þú ert með tvo grunna (FW og RV). Þau eru hönnuð á móti tilteknu markmiði eða gegn því að bindast nokkrum markmiðum, en eiga sameiginlegt að varðveita röð.

Í rauntíma PCR er notkun grunnar ásamt blómstrandi litarefni sem bindist innan tvístrengds DNA (einnig þekkt sem millikölnunarmiðill, svo sem SYBR grænn), eða með rannsaka sem bera fluorochrome og quencher. Báðar aðferðirnar (ef þú þarft að þekkja þær í smáatriðum, skal ég útskýra fyrir þér, en ég mun halda mig við aðalspurninguna) leyfa þér að fylgjast með mögnun DNA-sameindarinnar miðað við magnunarskrefið í rauntíma og láta rannsakandanum í té magngreiningu .

Af hverju er það gagnlegt?

Hvað gerir PCR? Það magnast. Hver uppörvunaratburður er kallaður uppörvunarferill. Venjulega eru magnunarhringirnir á hverri viðbrögð (milli 25 og 28) haldið undir 30 glösum. Af hverju það? Vegna þess að PCR er notað til að sjá hvort eitthvað er þar eða ekki, eða hvort eitthvað er meira eða minna til staðar í þessu ástandi miðað við stjórn. Ef styrkingarskrefin eru of mikil, geturðu ekki skilið hvort eitthvað er til staðar eða þú sérð merki bara af því að þú hefur það magnað svo oft að á einhverjum tímapunkti lítur það út eins og eitthvað sé til (hugur, það er ég) ekki "magngreina" vegna þess að venjuleg PCR gerir þetta náttúrulega ómögulegt).

Til dæmis var A minna en B. Mögnun byrjar og eftir 30 lotur keyrirðu hlaup og A og B hafa bæði sterkt merki. Svo þú segir „A = B, það er enginn munur á stjórnun og tilraun“. Þetta hefði ekki gerst ef þú hefðir aðeins gert 25 lotur. Sérðu hvað ég meina?

Á rauntíma PCR er hægt að sjá hringrás eftir hringrás hversu mikið Amplifcon (magnaði þráðurinn) var á þeim tíma meðan á þessari ákveðnu lotu stóð. Þannig að ef þú keyrir 30 lotur og færð niðurstöðuna geturðu sagt frá fyrri uppörvunarferli: „Allt í lagi, munurinn er raunverulegur“ eða „Það er enginn munur“.

Þetta virkar í raun frá hugbúnaðinum. Þeir hafa þröskuld (þannig að þú getur aðeins séð merkið þegar það er yfir ákveðinni stærð, þetta er hægt að setja rithöfundinn út frá eigin reynslu af þörfinni). Og eins og þú sérð byrjar fjöldinn á hásléttu fyrir ofan 30 hring. Á þessum tímapunkti verður ekki hægt að greina á milli hlutanna því þeir líta allir eins út! Hins vegar með hugbúnaðinum geturðu skoðað allar lotur og fengið yfirsýn yfir hvað hefur gerst hringrás eftir hringrás.

Ég vona að það hjálpi, ef þú þarft frekari upplýsingar eða skýringar, láttu mig bara vita.


svara 2:

Þú spurðir ekki en ég vil benda á að það er annað magn PCR kerfis sem verður sífellt vinsælli: stafræn PCR.

Gallinn við rauntíma PCR er að þú getur ekki náð raunverulegum megindlegum árangri án þess að gera neitt gegn stöðlum. Aðalástæðan fyrir þessu er að mismunandi amplicons hafa mismunandi magnunarvirkni, sem aftur getur haft áhrif á mismunandi viðbragðsaðstæður (svo sem einsleitni í hitastýringu með PCR plötunni) eða sýni mengunarefni. Stafræn PCR útrýma þessum vandamálum með því að umbreyta PCR í tvöfalt kerfi: annað hvort sést mögnun eða ekki.

Stafræn PCR samanstendur af því að framkvæma mörg PCR viðbrögð samhliða sama inntaksefni. Galdurinn er að þynna sýnið svo að búist er við að mörg viðbrögð hólf fái ekki sniðmátsameindir. PCR er framkvæmt og síðan er fjöldi jákvæða hólfa taldir. Ef þú setur þetta inn í jöfnur út frá Poisson dreifingunni færðu mat á fjölda innsláttarsameinda. Þar sem það er byggt á talningu fer fjöldinn ekki eftir venjulegu ferli. það er bara megindlegt.

Fjöldi stafrænna PCR-kerfa hefur verið markaðssett með borholum eða dropum fyrir hvarfhólfin. Þeir eru einnig mismunandi í fjölda PCR hólfa; Droplet-kerfin ná miklu, miklu hærri tölum. Nákvæmni og kraftmikið svið fer bæði eftir fjölda dropa - með fleiri hólfum geturðu verið lengra frá upphafsstyrk áætlunarinnar.

Mismunandi kerfin bjóða upp á mismunandi búnaðskostnað og einfalt verkflæði. Til dæmis er Fluidigm tækið að fullu samþætt, en að mínu mati er boðið upp á minna en 1000 hólf á hvert sýnishorn, meðan BioRad kerfið er með aðskildar fleygunar-, mögnun- og talningarstig (með tveimur sérstökum tækjum; hitahjólreiðar keyrir í venjulegu hitahreinsitæki) og hefur tugþúsundir hólf.